防止轻易衔接 然而关于图二 如图 这个 I把图甲切开后 I和EcoR 假设我用Pst 第一个图说 (防止轻易衔接的措施)

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• 如图，第一个图说“防止轻易衔接”，然而关于图二，假设我用Pst I和EcoR I把图甲切开后，这个
• 为什么双酶切可以防止自身环化?
• 为什么学会反向PCR如此关键？

如图，第一个图说“防止轻易衔接”，然而关于图二，假设我用Pst I和EcoR I把图甲切开后，这个

那个属于目标基因的自身环化，而不是轻易衔接。用两个不同的限度酶切目标基因，可以防止目标基因在连入质粒时反向衔接

为什么双酶切可以防止自身环化?

酶有特同性，不同的没切后粘性末端不同。

双酶切之后，由于用的两种酶切进去的粘性末端序列不一样，所以普通载体不会再自连。

为什么学会反向PCR如此关键？

当初，基因的启动子序列扩增；致癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座；以及病毒基因整合都会用到一种方法，该方法被称为反向PCR。

1 、原理 反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而惯例PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。

试验时决定已知序列外部没有切点的限度性内切酶对该段DNA启动酶切，而后用衔接酶使带有粘性末端的靶序列环化衔接，再用一对反向的引物启动PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序启动剖析,用此方法可建设基因组步移文库。

2、目标及运行 反向PCR的目标在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反响体系不是在一对引物之间而是在引物外侧分解DNA。

反向PCR可用于钻研与已知DNA区段相衔接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。

这时决定的引物只管与外围DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。

扩增前先用限度性内切酶酶切样品DNA，而后用DNA衔接酶衔接成一个环状DNA分子，经过反向PCR扩增引物的抢先片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这关于转座子拔出序列确实定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分关键。

同时， 它有助于钻研基因的启动子序列；致癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座；以及病毒基因整合。

该方法之所以被称为反向PCR，是由于引物设计用于向两头加长而不像惯例PCR中朝着彼此加长。

当初，反向PCR常被用于定点突变，复制一个具备预期突变的质粒。

在钻研基因组DNA未知序列的传统上班流程中，首先启动限度性酶切消化和衔接，再启动反向PCR，随后对PCR扩增子启动测序。

关于gDNA消化，需决定一种限度性内切酶启动酶切，以取得长度适合且能够自我衔接的片段。

同时，选定的限度性内切酶无法剪切已知序列，从而使衔接出现于侧翼未知序列之间。

经常使用低浓度的酶切DNA片段提升衔接步骤，使其偏差于自我衔接而非多片段衔接（即构成连环体）。

实现自我衔接后，从DNA的已知区域启动反向PCR。

所取得的扩增子每个末端都含有局部已知DNA序列。

随后，可从末端开局对这些扩增子启动测序，检测上述已知序列的相邻区域。

3、无余 ①须要从许多酶中决定限度酶，或许说必定决定一种适合的酶启动酶切能力获取正当大小的DNA片段。

这种决定不能在非酶切位点切断靶DNA。

②大少数有核基因组含有少量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知配置序列中有时也会有这些序列，这样，经过反向PCR获取的探针就有或许与多个基因序列杂交。