伯豪专业服务助力科学发现，单细胞转录组研究受限待突破？

伯豪专业服务 成就科学发现

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人类基因组计划实施后，测序技术特别是高通量测序技术飞速进步，人们对于基因组变异和表型关联的理解日益深入。不过，目前所有测序项目采用的材料都是组织或大量细胞的混合体，因此研究结果只是众多细胞数据的综合，或者是这群细胞的典型反映，单个细胞特有的信息常常被忽略。基因运作的层面上，各类细胞各自拥有与众不同的转录构成，即便那些外表相似的细胞集体，分子层面的RNA含量也相去甚远。理想状态下，转录组检测应当针对单个细胞实施，不过受限于检测的精确度等条件因素，多数转录组探究仍需依赖数十万乃至百万级别的细胞群体进行。[id_8[id_1346607971]302442]

二零一一年，《Nature Methods》把单细胞测序列为当年备受瞩目的技术之一，二零一三年一月，《Science》期刊将单细胞测序列为年度最引人注目的六大研究方向之首，二零一四年一月，《Nature Methods》又把单细胞测序列为二零一三年最重要的方法学突破，并且强调二零一三年发表在《Nature》系列期刊上的单细胞测序论文数量呈现急剧增长态势。单细胞测序技术如今常用于探究肿瘤细胞的多样性，寻找未曾识别的基因变异，解析肿瘤细胞如何逐步演变，以及发掘可能作为诊断依据的新指标。这种技术在追踪少量存在于血液中的肿瘤细胞，包括循环肿瘤细胞和浸润性肿瘤细胞方面特别有效，能够帮助医生在疾病初期就进行监测，进而实现为患者量身定制的精确治疗方案。

02单细胞分离技术

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单细胞测序首先需要解决单个目标细胞的分离难题，现阶段，常见的单细胞分离技术包括有限稀释技术、显微操控技术以及流式细胞技术。有限稀释技术属于一种经典方法，其核心原理在于将细胞悬液进行充分稀释，确保特定体积的样本中理论上仅含有一个细胞，随后借助移液工具吸取对应体积的细胞样本，即可获取单个细胞。这种方法不需要专用装置，现在依然在普遍使用，不过它需要借助梯度稀释来实施，并不是直接进行单细胞分离，所以实际操作中的成功率大约只有百分之二十，会出现很多空置情况或者多个细胞被一起处理，相比之下，显微操作技术是一种可以直接看到单细胞的办法，这种办法能够精确控制单个细胞的吸取和释放，但是对实验过程的要求很高，不利于扩大规模进行。而荧光激活细胞分选技术，能够批量获取单一细胞群体，此方法借助流式细胞分析仪器，依据细胞表层标记物，可以筛选出目标细胞群或单个细胞。这种方法虽然需要专用装置，并且细胞的消解和分离步骤会对细胞状况造成某些改变，不过它的运作效能和正确度都相当出色，操作规范一致，有助于各个研究机构实验成果的相互参照。

有时需要依据样本的详细状况，综合运用前述多种途径，以取得单个细胞，此外，新兴技术手段也为单细胞基因分析领域带来了有利条件。Silicon Biosystems公司位于意大利的DEPArray系统，运用非均匀电场对细胞施加作用力，同时参考形态学特征，可以识别并获取复杂混合样品中的单个细胞，操作全程无需物理接触或摩擦，确保细胞保持活性，且适用于多种细胞液态样本，同样能够处理穿刺取样和组织活检标本。Fluidigm 公司在美国的 C1 单细胞全自动制备系统，虽无细胞成像功能，却极大提升了自动化程度，该系统运用了新颖的微流体技术，起初能自动分离出 96 个单细胞，接着，在芯片上开展细胞破损、RNA 转录及预先扩增，整个过程首次达成了从单细胞制备到 cDNA 合成扩增的整体自动化和批量处理。但分离在细胞群体中罕见（

转录层面上的研究，既要得到单个细胞，又得尽量降低对细胞状况的干扰。现在，有些研究者对在非正常状态下“得出的生物学结论”产生了疑问，原因是目前关于基因活动转变的认识，大多来自对体外培养细胞进行的实验。所以，他们研究出一种前所未有的技术——体内转录组分析（TIVA），这项技术能够采集到生物体内活体组织单个细胞里的信使核糖核酸，同时不会对邻近的器官组织产生破坏。

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单细胞RNA测序的应用方向

（1）肿瘤异质性

基因表达方面，各类肿瘤细胞拥有各自的转录图谱，即便同看做一样的细胞集体，RNA层面差异也可能十分显著。某研究团队借助流式细胞技术，从五位病患体内提取脑胶质瘤细胞，对这些单细胞实施RNA测序，详尽解析了四百三十个细胞的数据，精确呈现了肿瘤细胞的内部构造。每种胶质母细胞瘤内部都混杂着多种癌症类型的细胞成分，不同肿瘤之间这些细胞成分的构成比例也大相径庭。针对黑色素瘤的一项分析，通过对19位患者的单细胞样本实施测序，最终解析出4645种独特的肿瘤细胞，这些细胞涵盖了恶性肿瘤细胞、免疫细胞、间质细胞以及内皮细胞等不同类别。研究结果显示，即便在同一肿瘤体内，恶性细胞所呈现的转录水平差异，与其所处的细胞周期阶段、空间位置分布以及耐药特性密切相关。

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常规识别和分离细胞亚群途径依赖于若干已知蛋白或核酸指标。然而针对部分罕见细胞种类，明确其专属标记物至今仍面临严峻困难。借助单细胞RNA测序技术并融合创新性算法，科研人员成功鉴定出小肠内若干稀有细胞类型，此项成果有助于深化对器官细胞结构的认知，为解析生理及病理情形下的组织生物学机制提供关键依据。这项研究或许有助于肿瘤学领域，识别出某些不常见的肿瘤细胞亚型，比如肿瘤干性细胞，或者是流窜式肿瘤细胞。

（3）肿瘤细胞耐药性机制研究及治疗

单细胞RNA测序不仅能得到基因表达情况，还能检测转录本中的变异位点。比如一项关于抗乳腺癌的文献，Paclitaxel（Taxol）是广泛应用的抗癌药剂，它通过抑制微管装配来阻止细胞分裂过程。这项工作运用单细胞RNA测序技术，对比了用药前后单细胞内存在的SNV，发现在单个细胞层面能识别出许多群体测序遗漏的SNV，并且发现了与耐药细胞相关的特异性SNV，这些SNV同微管结构的形成与稳固，以及细胞间的粘附和细胞表面信号传递存在关联。针对肺癌，科研人员借助PDX模型，借助单细胞RNA测序技术，对比了用药前后基因表达状况，借助聚类分析手段，把细胞划分成四个类别，并最终识别出与产生抗药性有关的细胞群体。

剖析单个CTC有助于阐明肿瘤产生抗药性和复发的原理，当前已有诸多相关研究进行探索。比如借助Smart-Seq技术，研究人员首次考察了复发黑色素瘤病患血液里单个CTC的基因活性情况。与先前黑色素瘤不同，部分膜蛋白的显现方式出现明显差异，个别基因的活性减弱与肿瘤生长、转移存在关联，另有一些基因则辅助肿瘤循环细胞逃逸机体免疫机制的侦查。去势治疗（ADT）是前列腺癌普遍采用的治疗方式，不过当肿瘤复发时，雄激素受体（AR）阻断剂的成效因个体而异。哈佛医学院的科研人员借助基础的液体检测手段，采集到循环肿瘤细胞，并对其开展单细胞RNA测序检测，阐明了前列腺癌的耐药原理。这些研究人员从十三名显现雄激素抵抗状况的病患身上，提取了七十七例循环肿瘤细胞，继而执行了全部RNA序列的检测工作。对比接受AR治疗的AR耐药患者血液样本与未接受治疗者血液样本中的循环肿瘤细胞，观察到AR耐药组存在nc-Wnt信号通路被激活的情况；众所周知，Wnt信号通路是控制细胞存活、生长及迁移能力的信号路径，因此它也影响癌细胞的抗药性机制。

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单细胞RNA测序检测分析平台

单细胞RNA扩增的技术+二代测序：最初的方法是2009年提出的Tang’s method。Quartz-Seq的技术，本质上是对Tang的方法做了改进，显著降低了扩增副产物的生成，并且使实验步骤更为简便。CEL-seq则是通过使用IVT技术来替代PCR，从而实现扩增功能。（单细胞标记逆转录，STRT）是SMART方法中第一种技术的名称，不过这种方法仅能对转录本起始部分进行检测，无法测定其全部序列。而后续研发的Smart-Seq系列技术，包括Smart-Seq和Smart-Seq2，则实现了对转录体完整链的测定。这类方法已经配备了性能稳定的商业化试剂包，因此在当前研究中得到了广泛采用。

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单细胞多组学测序

生命活动的产生和调节过程非常繁复，在癌症等疑难病症的形成演变期间，会牵涉到基因、转录以及表观遗传等不同层面的变异和调控，这些层面相互交织。当前这个信息爆炸的时期，把各种组学资料综合起来进行整体性探究——也就是多组学（Multi-omics）研究，已经成为一个显著的发展方向。基因组学等多组学分析有助于全面把握疾病演变动态，为肿瘤调控机理探索和个体化诊疗开辟途径。尽管在单个细胞层面同步测定基因组图谱、转录图谱及甲基化状态存在挑战，但科研人员已研发出若干应对策略。

（1）单细胞DNA和RNA平行测序

单细胞G&T-seq技术能够同时对单个细胞的DNA和RNA进行测序，可以揭示基因变异与基因功能之间的联系，该技术有助于分析单细胞基因型和表现型之间的关联，深入阐明DNA信息如何调控细胞状态，真正实现了对同一细胞在特定时间空间内遗传物质的全面探究。

（2）单细胞RNA和甲基化平行测序

DNA甲基化能够控制基因的转录程度，也就是RNA的产出量，scM&T-seq技术能够对单个细胞内的RNA和DNA甲基化进行检测。同济大学的一个研究团队通过对同一个细胞的细胞质和细胞核分别实施RNA检测和DNA甲基化检测，同样完成了单个细胞的RNA和甲基化同步检测。

（3）单细胞基因组，转录组，甲基化平行测序

国内多个研究团队研发出一种创新性的单细胞三组联合检测技术（scTrio-seq），国际上首次实现从单个细胞中同步获取三种组学的高通量分析数据，并且从细胞层面揭示出肝癌细胞在三种组学维度上展现出紧密关联的显著差异性。借助这项技术，研究人员对一位肝细胞癌患者的癌组织样本中的25个癌细胞进行了三种组学的同步检测分析。三种组学分析显示这25个肝癌细胞源自两个不同细胞类别。深入比较两个类别的组学差异表明，数量较少的亚群I细胞具备更多DNA数量变异和更显著的DNA甲基化现象，或许更难被患者免疫防御系统侦测到，因此可能更倾向于扩散转移。

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大规模低成本的单细胞测序方法

单细胞测序当前面临的主要障碍在于费用高昂，特别是在需要处理海量细胞进行检测的情况下。尽管测序环节本身的费用已经显著降低，但由于每个细胞都必须分别完成扩增和文库制备，相关试剂的开销相当巨大。

哈佛大学医学院的专家们构思了两种基于微滴的不同技术，分别是Drop-seq和inDrop。他们借助微流体设备，把附着有扩增引物且引物上带有用于判别细胞出处的条码的微珠，以及细胞，一同置入微小的液滴之中。由此创立了一种迅速、经济、能大规模分析的单细胞RNA测序技术。该技术能够同时检测成千上万的细胞。研究团队指出，Drop-seq 以及inDrop 可辅助科研人员更精细地分辨人体细胞的种类，进而描绘出复杂组织内细胞种类的丰富性分布图。与此类似的技术还包括SCRB-Seq ，CytoSeq 等。

另外，10X genomics公司的Chromium平台，借助微流控手段将细胞自动分配至十万到一百万个微反应单元，每个微反应单元均含有一种独特的条形码序列；带有条形码信息的凝胶微球（GEMs）起初与样本及酶的混合物相融合，随后与位于微流体“双十字”结构内的油类表面活性剂溶液相接；GEMs最终流至收集槽并加以汇集。凝胶小球消融时释放条形码片段，由此对样本实施标记；接着把含有条形码成分的液滴汇集起来，再制备成标准化的测序资料库。借助这种方法，科研工作者从三十份样本里获取了约二十五万个单细胞基因表达图谱。分析表明这套装置检测精度非常突出，并且能够识别出非常罕见的细胞类别。

10X Genomics技术原理

最新一项科研进展为单细胞测序技术实现了重大突破，预计可将单个细胞的测序费用降低到1美分。SPLiT-seq技术能够适用于经过甲醛处理过的细胞或细胞核，并且不需要昂贵的专用仪器设备。它省去了采用定制化微流体装置或其他微孔分选单细胞这一步骤，而是利用细胞自身作为其RNA的独立空间。将细胞群体分成若干小组，并引入价格低廉的混合条形码标记。SPLiT-seq技术的核心环节，本质上是一种“重新组合”的操作，经过这四个步骤，原则上能够产生21,233,664种条形码搭配（在96孔载体上实施三次条形码标记，随后开展第四次聚合酶链式反应，能够针对性地识别超过一百万个细胞），目的是为每一个细胞分配一个独一无二的条形码序列。

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技术难点及需要解决的问题

单细胞采集，现阶段多数单细胞转录组分析依赖单细胞液态样本，例如组织分离液或细胞培养液，作为检测材料，细胞在分离、筛选期间，其转录情况是否出现变化，是必须关注的一个焦点，这种样本无法体现细胞在组织内的空间排列方式，除非明确这些细胞源自组织的特定区域。此外，形形色色的细胞组合成一个错综的体系，由此产生组织和器官的综合作用，单个的细胞脱离后破坏这种综合性，所以我们必须继续深入探索微环境条件下单个细胞基因转录的探究。

单细胞内RNA含量微乎其微，因此单细胞转录组分析关键在于RNA的逆转录及后续扩增，但此类操作极易产生错误或造成信息遗失，进而引发诸多偏差。多数科研工作者会着力压缩PCR的扩增周期，目的是降低由此产生的偏差，而且线性复制方法也能在一定程度上缓解这种由复制过程引发的偏差。

扩增方法存在显著差异，体现在信息保留方面，例如可采用完整扩增和测序转录本的方式，从而获取全部基因及其各类转录变体的构造细节，或者选择仅扩增转录本五端或三端的策略，以此反映基因表达的相对水平。很多扩增和建库步骤会遗失转录的方向资讯，这种资讯对于基因表达定量精确度，反义转录本以及其他非编码RNA的探究极为关键，非编码RNA信息的保存或许会变成未来扩增方法优化的方向。

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展望

近些年借助单细胞测序方法，关于癌症成因、肿瘤演进、扩散及抗药性等方面的研究获得了突破性进展。通过解析循环肿瘤细胞，单细胞测序阐明了肿瘤细胞的多样性及其抗药性原理，使CTC成为非侵入式癌症诊断、追踪和靶向治疗的关键工具。现阶段，单细胞测序在肿瘤精准探索领域尚处萌芽期，并且遭遇诸多困难。技术的持续发展与革新，将使单细胞检测方法在未来肿瘤的精确研究以及治疗方面展现出极为广阔的前景。