人工抗原的制备是什么样的 (人工抗原的制备涉及什么问题呢)

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人工抗原的制备是什么样的？

半抗原与载体蛋白的耦联物称之为人工抗原。

载体不仅是简单地增加半抗原的分子质量，更重要的是利用其强的免疫原性诱导机体产生免疫应答，对半抗原发生载体效应的作用。

蛋白质结构越复杂，免疫原性越好。

常用的载体蛋白有牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、兔血清白蛋白（RSA）、人血清白蛋白（HSA）、人γ球蛋白（γ－GA）、人血纤维蛋白、钥孔血蓝蛋白（KLH）、甲状腺球蛋白（thyroglobulin）、猪血清白蛋白（PSA）等。

半抗原含有的活性基团不同，半抗原与载体蛋白耦联的方法也不同。

通常，含羧基的半抗原采用碳二亚胺（EDC）法、混合酸酐（MA）法和Woodward试剂法；含羟基的半抗原采用琥珀酸酐法；含羟基的半抗原采用戊二醛法、一氯醋酸钠法和偶氮苯甲酸法；含酚基的半抗原采用重氮化法；含氨基的半抗原采用Mannich反应、重氮化法和丙烯酸法、二异氰酸酯法、卤代硝基苯法、亚胺酸酯法；含酮基的半抗原采用氨基氧乙酸法；含巯基的半抗原采用SAMSA（S－乙酰基巯基琥珀酸酐）法等。

耦联后的人工抗原往往需要进一步纯化。

透析是常用的方法，还可采用凝胶柱层析的方法分离。

半抗原与载体蛋白的分子结合比对抗体特异性和效价有一定的关系。

一般认为人工免疫抗原结合比高，可以增加免疫刺激的强度和特异性。

目前，绝大多数农药人工抗原是通过将单一农药半抗原耦联到载体蛋白分子上的方法获得的。

所获得的抗原称之为单一决定簇人工抗原。

王姝婷等通过对人工抗原的设计，将克百威、三唑磷、毒死蜱和甲基对硫磷半抗原耦联到一个载体蛋白分子上，制备出了多抗原决定簇的人工抗原，并获得了能同时识别上述4种农药的“宽谱特异性”（broadspecificity）多克隆抗体。

这为农药人工抗原的制备提供了一种新的途径和策略。

人工抗原的制备是什么样的？

1. 人工抗原是指将半抗原与载体蛋白结合而成的物质。

2. 载体蛋白的作用不仅是增加半抗原的分子量，更重要的是通过其强烈的免疫原性引发免疫反应，从而对半抗原产生载体效应。

3. 蛋白质的结构越复杂，其免疫原性通常越强。

4. 常用的载体蛋白包括牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）等多种，这些蛋白能够用于耦联不同的半抗原。

5. 半抗原的活性基团种类决定了与载体蛋白耦联的方法。

例如，含有羧基的半抗原可以通过碳二亚胺（EDC）法等方法耦联。

6. 耦联完成后，人工抗原通常需要经过透析和凝胶柱层析等纯化步骤。

7. 半抗原与载体蛋白的分子结合比例会影响抗体的特异性和效价，高结合比通常能增强免疫刺激的效果。

8. 目前，多数农药人工抗原是通过将单一农药半抗原连接到载体蛋白上来制备的，这种抗原被称为单一决定簇人工抗原。

9. 研究人员已经通过设计人工抗原，实现了将多种农药半抗原耦联到单一载体蛋白上，从而制备出能识别多种农药的多克隆抗体，这展示了制备农药人工抗原的新方法和策略。

帮忙翻译一下。

近20年来,碳二亚胺系列缩合剂,如N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的研究引起广泛兴趣,并因其具有反应条件温和,产率高,选择性好,对环境友好等特点而得到普遍应用[1]。

碳二亚胺作为脱水剂的反应机理如下:首先羧基1与碳二亚胺反应生成中间体O-酰基异硫脲2,引入酯基活化羧酸。

2再与胺反应生成目标产物酰胺3和脲4。

2可以与另一分子的羧酸反应生成酸酐5,酸酐与胺反应液得到酰胺3。

同时,2会重排生成副产物N-酰基脲6。

从该反应机理可以看出,碳二亚胺容易生成副产物脲,而DCC的反应产物N,N-二环己基脲不溶于水,一般用过滤除去,但仍有少量残留于溶液中,难以除净。

与DCC相比,DIC为液态,更容易使用;同时产物N,N-二异丙基脲可溶于有机溶剂,很容易通过溶剂萃取除去,DIC常用在固态合成中,DIC用作DCC的替代品。

EDC是碳二亚胺系列中活性较高的脱水剂,作为第二代水溶性缩合剂和偶联剂,无需在无水的条件下进行,试剂不需要干燥处理,具有反应时间更短,效率更高,易于操作[2]等优点。

EDC主要用做生物多糖[3-4]、多肽、蛋白质、核苷酸合成[5]、高分子改性[6]和有机合成[7]的缩合剂和交联剂。

EDC在有机合成中的应用受到极大关注,本文对近些年国内外EDC在有机合成,生物化学合成中的应用情况进行了综述。

1󰀁EDC在有机合成中的应用1.1󰀁EDC用于酰胺的反应EDC在NHS作用下,可以大大提高缩合效率[8-9],有利于偶联反应的进行[10-11]。

2007年,GuangyuanLu等[12]将壳聚糖用EDC进行交联,得到含酰胺的壳聚糖。

羧基先与EDC反应生成中间体,NHS在与中间体生成酯,最后与伯胺反应生成酰胺。

2008年,[13]将己二酸与4,4-二胺基苯甲烷盐酸盐反应生成高分子化合物,这种高分子薄膜表现出良好的纳米性能。

2009年,OrlaMcCarth等[14]将叔丁基二苯基氯硅烷与正丙醇胺反应所得产物在EDC的作用下与脲嘧啶-1-乙酸反应得到酰胺。

同时还合成了一系列嘧啶类酰胺类化合物,这类新药抗寄生虫效果明显。

2008年,[13]将己二酸与4,4-二胺基苯甲烷盐酸盐反应生成高分子化合物,这种高分子薄膜表现出良好的纳米性能。

2009年,OrlaMcCarth等[14]将叔丁基二苯基氯硅烷与正丙醇胺反应所得产物在EDC的作用下与脲嘧啶-1-乙酸反应得到酰胺。

同时还合成了一系列嘧啶类酰胺类化合物,这类新药抗寄生虫效果明显。

2009年,IvankaStankova[15]用EDC为偶联剂,4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂,在DMF中,少量三乙胺存在的条件下,将羧基化合物和伯胺反应,得到一系列产物,产率可达80%以上。

1.2󰀁合成酯的应用2001年,JinmaoYou[16]用4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为催化剂。

在相同条件下,EDC作为脱水试剂的反应速率是DCC的八倍,同时反应产率也较其他缩合剂有很大提高。

2001年,张盛龙将羧基转化为氨基反应活性的Sulfo-NHS活泼酯[17]。

1.3󰀁用于分子内脱水EDC作为缩合剂,具有反应条件温和,产率高,选择性好,对环境友好等特点。

在有机合成各方面都广泛应用[18]。

例如EDC可以将醇选择性脱水生成顺式或反式的肉桂酸[19-20]。

2󰀁生物合成中的应用2.1󰀁在EDC作用下DNA的磷酸基团参与的反应EDC作为偶联活化剂,将单链DNA偶联到氨基(-NH2)包围的介质表面。

而且以磷酸氨基酯键的形式共价结合在电极表面[21],用作电化学DNA生物传感器的设计。

徐春等[22]用EDC作为活化剂,将电化学活性物质溴化乙锭成功标记在人工合成的DNA片段,制备成DNA探针;用电化学方法将待测样品DNA片段固定在石墨电极表面,在一定的温度、PH值和离子强度条件下与溴化乙锭标记DNA探针进行杂交反应,从而对DNA片段进行识别和测定。

同时用EDC作为偶联剂,利用缩合反应分别将电化学活性物质氨基二茂铁和醛基二茂铁成功地标记在DNA片段上,制备成二茂铁标记DNA探针[23]。

2.2󰀁小分子半抗原与大分子载体蛋白结合2009年,孙晔等[24]将半抗原与载体卵清蛋白(OVA)形成免疫抗原,并利用该试剂制备出免疫原性很强的溴氰菊酯人工抗原,制备过程操作简单、合成期短、产率较高。

黄曲霉毒素(简称AFB1)是毒性很强的真菌毒素,AFB1属小分子半抗原,2005年,江湖等将其与大分子载体蛋白偶联,作为免疫原或检测抗原[4]。

最近,YuanyangZhang等[25]去甲雄三稀醇酮的半抗原与牛血清白(BSA)蛋白反应制作免疫蛋白抗原。

在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的情况下,EDC可将羧基转化成活性基团,用于测定分析。

2005年,李丹等[26]将一带羧基的巯基丙酸(MPA)SAMs组装在镀金石英晶振表面,通过应用偶联试剂(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共价固定抗体,直接测定人血清中补体。

2008年,车宏莉[27]采用混合自组装单层膜技术在石英晶振电极表面制备巯基(MPA)和巯基乙醇(ME)混合功能基底模,通过偶联剂(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化混合膜上富含的羧基用于日本血吸虫抗原(SjAg)的高效共价固定。

3󰀁其他应用等[28]利用EDC合成吲哚生物碱的新方法,该法比用DCC产率得到很大提高。

2003年RafaelChinchilla[29]等将EDC作为苯甲酸酰胺化反应的缩合剂。

利用EDC制作纳米材料也得到广泛的应用[30]。

2002年,SarbajitBanerjee等用高锰酸钾氧化纳米管制作含羧基纳米管,在与氨基包围的二氧化钛纳米颗粒反应,制作纳米材料[31]。

对高聚物支载型EDC研究也是一个很热门的领域[32-33],如将大量不同的胺和羧酸在高聚物支载型EDC的作用下合成酰胺。

这些高聚物支载型EDC易于提纯,产率更高,同时具有易保存、反应后处理简便等优点会受到更大的应用。

4󰀁结󰀁语综上所述,EDC在有机合成中,从最传统的酰胺、酯类的合成扩展到越来越多的领域,比如分子内的脱水、杂环的合成,这些合成化合物已经在生物化学、分析化学得到了广泛的应用。

相信随着研究的深入,EDC作为水溶性的第二代碳二亚胺系列类缩合剂、交联剂,在有机合成、分析化学以及纳米材料领域应用必将越来越广。